Ing. Pavlína Jaklová; Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o.

V průběhu let se ošetřování fungicidy stalo hlavním prostředkem ochrany jabloní proti původci strupovitosti – houbě Venturia inaequalis (Cooke) G. Winter (1875) (anamorfa – konidiové stadium Spilocaea pomi Fr., 1825).

Toto intenzivní používání fungicidů může vést k selekci rezistentních kmenů patogenu zejména vůči ohroženým skupinám fungicidů, moderním systémovým či částečně systémovým fungicidům, které zasahují specifický biochemický děj v metabolizmu patogenu, jako jsou: Anilinopyrimidiny, DMI fungicidy (triazoly), QoI fungicidy (strobiluriny) a SDHI fungicidy.

Ochrana proti strupovitosti patří k nejdůležitějším a finančně velmi náročným opatřením, které určují zejména kvalitu sklizně, výši sklizně a mají tak značný vliv na rentabilitu produkce. Zpřesnění systému ochrany jabloňových sadů na základě získaných poznatků o rezistenci/citlivosti houby V. inaequalis je žádoucí z mnoha důvodů:

1. zabránit neúčelnému použití neúčinných fungicidů tam, kde se již vytvořila rezistence patogenu;
2. a tím zvýšit účinnost ochrany a předejít ekonomickým ztrátám z použití nesprávného přípravku;
3. předejít zbytečné zátěži životního prostředí cizorodými látkami;
4. zahájit používání fungicidů z jiné skupiny s odlišným mechanizmem působení pro zajištění efektivní ochrany jabloní proti chorobě a pro zachování kvalitní produkce.

Příznaky napadení houbou V. inaequalis na listech jabloně

Příznaky napadení houbou V. inaequalis na plodech jabloně

Rezistence vůči fungicidům

Nástup rezistence je spojen s celkovým nebo téměř úplným selháním chemické ochrany nad chorobou. Samozřejmě je nutné prokázat, že rezistence je skutečnou příčinou, kdy je za kontrolovaných podmínek pomocí laboratorních nebo skleníkových testů zjištěna snížená citlivost patogenu k fungicidu. V případě zjištění snížené účinnosti ochrany je vhodné zaslat vzorek na odborné pracoviště, aby bylo vyloučeno nebo potvrzeno snížení citlivosti patogenu.

Existuje však mnoho dalších možných důvodů, které vedou k neuspokojivým výsledkům aplikovaných ochranných opatření. Tím zásadním a nejběžnějším důvodem je nepříznivý vývoj počasí, kdy do období plánovaného termínu ošetření přijdou trvalejší srážky, které znemožní aplikaci postřiku a způsobí jeho odložení. Zvláště kritickým je období intenzivního růstu jabloní, kdy v průběhu 7 dní vyvine jeden až dva nové listy, které již nejsou pokryty fungicidním filmem a současně jsou nejcitlivější k infekci. Dalšími důvody jsou například: Nedodržení dávkování, vysoká pojezdová rychlost, částečné smytí (zejména kontaktních) fungicidů, postinfekční aplikace přípravku s nižší kurativní účinností, nepříznivé mikroklima v některých částech výsadby, vysoký infekční tlak choroby i postupná selekce stále agresivnějších ras patogenu, který je schopen rychlejšího vývoje (Kloutvorová et al., 2019).

QoIs (Quinone Outside Inhibitors) fungicidy

Tato skupina je ohrožena vysokým rizikem vzniku rezistence a zahrnuje tzv. strobilurinové fungicidy, které inhibují buněčné dýchání a ovlivňující tak tvorbu energie potřebnou pro buňku patogenu. Rezistenci zapříčiňují mutace v cílovém místě účinku v genu klíčového proteinu dýchacího řetězce – cytochromu bc1 (gen cytb) – mutace G143A, která patogenu poskytuje vysokou úroveň rezistence, ale i další mechanizmy, jako je např. indukce alternativního dýchání. Křížová rezistence je prokázána mezi všemi fungicidy QoI skupiny (Anonym 1, 2020). Při výskytu rezistence vůči QoI fungicidům v mnoha případech všechny možnosti regulace patogenu selhávají, a to z důvodu výskytu rezistence tzv. kvalitativního typu.

Mutantní jedinci mají vysokou fitness (životaschopnost), dlouhodobě přežívají v populaci i po vyloučení selekčního tlaku ze strany fungicidů a nejsou účinné ani vyšší dávky či častější aplikace. Fungicidy patřící do třídy QoI inhibitorů využívané v ochraně proti strupovitosti v České republice jsou: Discus (kresoxim-methyl), Zato 50 WG (trifloxystrobin), přípravky s účinnou látkou pyraklostrobin – Tercel (+ dithianon), Bellis (+ boscalid) a Flint Plus (+ captan) (Anonym 2, 2020).

Na základě monitoringu provedeného v letech 2017 a 2018 mezinárodní organizací FRAC (Fungicide Reistance Action Committee), kdy byl ve většině evropských zemích infekční tlak V. inaequalis mírný, bylo potvrzeno, že rezistence vůči QoI fungicidům je stále v populaci patogenu přítomna. Ačkoliv zjištěné úrovně rezistence založené na detekci mutace G143A byly často velmi různorodé, od nulové až po vysoké, dokonce i mezi sousedními sady.

V roce 2019 byl ve spolupráci s VŠÚO s.r.o., ÚKZÚZ a MZe ČR proveden celoplošný monitoring citlivosti V. inaequalis k fungicidům (konkrétní výsledky z jednotlivých lokalit budou uveřejněny na webu Rostlinolékařského portálu). Pomocí metody real-time PCR (užitný vzor č. 31 547; Čmejla a kol., 2017) bylo celkem otestováno 31 populací V. inaequalis. Pomocí této metody je možně zjistit procentuální podíl zastoupení mutace G143A ve vzorku populace 10 milionů konidií (tato mutace je hlavní příčinou rezistence vůči QoI fungicidům). Naprostá většina (21) testovaných populací V. inaequalis měla vysoké zastoupení mutované varianty genu cytb (tj. mutace G143A), které se pohybovalo v rozmezí 73,42–100 %, tyto populace lze označit za rezistentní vůči strobilurinům, ve většině případů se jednalo o populace z integrované produkce či konvenčně ošetřovaných výsadeb jabloní. Celkem 9 populací V. inaequalis mělo nízké zastoupení mutované varianty genu cytb a to v rozmezí 1,69–19,85 %. Jednalo se zejména o populace V. inaequalis z ekologické produkce, ale i z integrované produkce a z několika výsadeb s konvenčním ošetřováním. Na základě výzkumu v předchozích letech bylo zjištěno, že procentuální zastoupení mutace G13A není významně ovlivněno frekvencí používání přípravků na bázi strobilurinů, např. výsadby, kde strobiluriny nepoužívají více než 5–10 let, tak zastoupení mutace G143A ve vzorku populace je nad 90 % (Jaklová et al., 2018).

Většina pěstitelů uvádí, že strobilurinové přípravky používají zejména v kombinovaných přípravcích proti skládkovým chorobám a jejich používání výrazně omezili, avšak jejich pravidelným, i když omezeným, používáním vysoký výskyt mutace v populace podporují. Mutované kmeny v populacích V. inaequalis tedy nadále úspěšně přežívají, a pokud by nastala situace, že by se opět začaly strobiluriny používat v sólo aplikacích, došlo by k jejich totálnímu selhání.

DMIs (DeMethylation Inhibitors) fungicidy

Tyto fungicidy inhibují biosyntézu sterolů v buněčných membránách patogenů.  Steroly, jako právě např. ergosterol, jsou důležitými složkami plazmatické membrány buňky, kde napomáhají k jejímu správnému vývoji a funkci. Chemickou skupinou patřící do DMI inhibitorů, která je nejvíce využívána v ochraně proti strupovitosti v České republice, jsou především triazoly. Rezistence patogenu vůči DMI fungicidům má kvantitativní charakter. Vznik rezistence je řízen akumulací několika nezávislých mutací a rozvíjí se jako postupné snižování citlivosti k fungicidům. U DMI fungicidů je známo několik mechanizmů rezistence, jako je např. snížená akumulace fungicidu uvnitř buňky díky zvýšenému vylučování transmembránovými přenašeči, mutace cílového místa v genu proteinu C14-demetylázy (gen CYP51) a nadměrná exprese cílového genu během tvorby ergosterolu. Předpokládá se, že kombinace uvedených mechanizmů rezistence jsou příčinou snížené účinnosti DMI fungicidů v polních podmínkách. Detekce kmenů patogenu se sníženou citlivostí k DMI fungicidům nemusí nutně znamenat ztrátu kontroly nad chorobou, v tomto případě jsou účinné vyšší dávky či častější aplikace. Ztráta kontroly závisí na úrovni rezistence (počtu mutovaných genů) a frekvenci výskytu rezistentních kmenů, které se vyskytují v populaci patogenu.

Při vyloučení selekčního tlaku dochází poměrně rychle k obnově citlivosti populace, jelikož mutantní jedinci mají nízkou fitness. Úroveň rezistence je i po dlouhé době používání značně variabilní a tyto přípravky vykazují stále poměrně dobrou nebo přijatelnou účinnost. Je prokázána křížová rezistence mezi různými účinnými látkami DMI fungicidů. I když je rezistence V. inaequalis vůči DMI fungicidům studována více než 25 let, stále není plně pochopena (Ishii & Hollomon, 2015). Na trhu jsou DMI fungicidy zastoupeny přípravky s účinnými látkami: difenoconazol (Atos, Difcor 250 EC, Score 250 EC aj.), tetraconazol (Domark 10 EC), penconazol (Topas 100 EC) (Anonym 2, 2020).

Na základě monitoringu organizace FRAC provedeného v letech 2017 a 2018 si DMI fungicidy v ochraně proti V. inaequalis udržují stále dobrou účinnost, pokud jsou používány dle doporučení výrobce a jsou dodržovány zásady antirezistentní strategie. Rozložení v citlivosti populací V. inaequalis se nemění od roku 2011, kdy výskyt méně citlivých kmenů patogenu je nízký a stabilní (Anonym 3, 2020).

Na pracovišti ČZU byl proveden výzkum rezistentních populací V. inaequalis pomocí metody otrávených ploten a pomocí molekulárně diagnostické metody overexprese genu CYP51, kdy dle literatury, čím vyšší je exprese tohoto genu, tím více fungicidům je daný izolát rezistentní. Pomocí těchto metod byly zjištěny rezistentní populace patogenu na našem území (Maňasová et al., 2019). V roce 2018 byla testována na pracovišti VŠÚO s.r.o. citlivost 5 populací V. inaequalis z konvenčně ošetřovaných výsadeb jabloní k fungicidu Score 250 EC (úč. l. difenoconazol) pomocí skleníkových testů dle metodiky FRAC, kdy snížená citlivost byla potvrzena u 3 populací.

Anilinopyrimidiny (AP fungicidy)

Tato skupina je ohrožena středním rizikem vzniku rezistence. Cílovým místem účinku těchto fungicidů je syntéza aminokyselin a proteinů v buňce patogenu. Konkrétně mechanizmus účinku spočívá v inhibici biosyntézy methioninu a inhibici sekrece hydrolytických enzymů. Anilinopyrimidiny vykazují v rámci své chemické skupiny křížovou rezistenci, ale nevykazují křížovou rezistenci s jinými skupinami fungicidů, jako jsou QoI, DMI či SDHI fungicidy. Potenciální příčinou rezistence vůči AP fungicidům jsou mutace v regulaci biosyntézy methioninu (cgs gen), případně alternativní mechanizmy, jako je nadměrná exprese genu nebo vylučování fungicidu z buňky transmembránovými přenašeči (Ishii & Hollomon, 2015). Z této chemické skupiny jsou v České republice využívány proti V. inaequalis účinná látky pyrimethanil (Batalion, Mythos 30 SC, Scala), kombinovaný přípravek Faban (+dithianon) a účinná látka cyprodinil (Chorus 50 WG, Vedette) (Anonym 2, 2020).

V Evropě dle výsledků monitoringu provedeného mezinárodní organizací FRAC pomocí skleníkových testů, byl v roce 2016 a 2017 zaznamenán snižující se trend výskytu rezistentních populací V. inaequalis v produkčních výsadbách jabloní. Populace V. inaequalis byly charakterizovány více jako citlivé, méně jako středně adaptované, ale byl zaznamenán výskyt i rezistentních populací. V roce 2018 se situace stabilizovala, což nasvědčuje tomu, že stávající antirezistentní strategie jsou účinné.

Anilinopyrimidiny si i po několikaletém používání stále udržují relativně stabilní účinnost (Anonym 4, 2018).

V roce 2019 byl ve spolupráci s VŠÚO s.r.o., ÚKZÚZ a MZe ČR proveden celoplošný monitoring citlivosti V. inaequalis k fungicidům (konkrétní výsledky z jednotlivých lokalit budou uveřejněny na webu Rostlinolékařského portálu). Kdy pomocí skleníkových testů dle metodiky FRAC byla otestována citlivost celkem 17 populací V. inaequalis z konvenčně ošetřovaných výsadeb k fungicidu Mythos 30 SC (pyrimethanil). Naprostá většina (13) testovaných populací V. inaequalis vykazovala citlivost k fungicidu, výjimku tvořily 3 populace, které lze považovat za méně citlivé.

SDHIs (Succinate DeHydrogenase Inhibitors) fungicidy

Fungicidy z této skupiny inhibují mitochondriální dýchání podobně jako QoI fungicidy, ale v jiné metabolické dráze a ovlivňují tak tvorbu energie potřebnou pro buňku patogenu. Cílový místem účinku je enzym sukcinát dehydrogenáza (SDH). Enzym SDH se skládá ze čtyř podjednotek (A, B, C a D). Vazebné místo fungicidu je tvořeno podjednotkami B, C a D. Bodové mutace, které mají za následek sníženou citlivost, se mohou rozvíjet u všech třech podjednotek. Důsledkem záměny aminokyselin (mutací) v různých SDH podjednotkách dojde k ovlivnění citlivosti k fungicidům. U V. inaequalis to je mutace v podjednotce C – H151R.

Většina z identifikovaných mutací má za následek nízkou až střední rezistenci a frekvence výskytu rezistentních kmenů v populaci prozatím zůstává nízká (Anonym 5, 2017). Různé mutace cílového místa odpovídají za různé/proměnlivé stupně citlivosti patogenu k jednotlivým SDHI látkám (Scalliet et al., 2012). Fungicidy patřící do třídy SDHI využívané v ochraně proti strupovitosti v České republice jsou Sercadis (fluxapyroxad), Fontelis (penthiopyrad), dále kombinované přípravky s účinnou látkou fluopyram – Luna Experience (+ tebuconazol ze skupiny DMI), s účinnou látkou fluapyroxad – Dagonis (difenoconazol ze skupiny DMI) a s účinnou látkou boscalid – Bellis (+ pyraclostrobin ze skupiny QoI fungicidů).

Tab. 1: Orientační tabulka klíčových fungicidů ohrožených rezistencí používaných v ochraně jabloní proti V. inaequalis

FRAC kód (číslo skupiny)	Účinná látka	Příklad komerčního přípravku	Poznámka
7 SDHI fungicidy	fluopyram	Luna Experience, Luna Care	riziko rezistence vysoké (ev. střední až vysoké)
	fluxapyroxad	Dagonis, Sercadis
	penthiopyrad	Fontelis
	boscalid	Bellis
QoI fungicidy	pyraclostrobin	Bellis, Tercel	křížová rezistence mezi všemi strobilurinovými látkami
	kresoxim-methyl	Discus
	trifloxystrobin	Zato 50 WG, Flint, Flint Plus
9  AP fungicidy	cyprodinil	Chorus 50 WG, Vedette	střední riziko rezistence (ev. nízké až střední)
	pyrimethanil	Mythos 30 SC, Pyrus 400 SC, Scala, Faban, Batalion 450 SC, Gladius 450 SC, Minos, Minos Forte, Pomax
12 PP-fungicidy (PhenylPyrrolové fungicidy)	fludioxonil	Geoxe 250 WG, Pomax	riziko rezistence nízké až střední
3 DMI fungicidy	difenoconazole	Score 250 EC, Difcor 250 EC, Vigofun 250 EC, Difenzone, Rekin 250 EC, Mavita 250 EC, Novadifen, Atos, Dagonis, Embrelia	riziko rezistence střední
	myclobutanil	Talent
	penconazole	Topas 100 EC
	tebuconazole	Luna Experience
	tetraconazole	Domark 10 EC
33 Ethyl-fosfáty	fosetyl-Al	Aliette 80 WG, Luna Care	nízké riziko rezistence
U 06 Fenyl-acetamidy	cyflufenamid	Cyflamid	střední riziko rezistence (nalezeno u Sphaeroteca)
M 01 Měďnaté fungicidy	měď a soli	Kuprikol……Airone SC, Badge WG, Coprantol Duo, Funguran Progress, Funguran OH 50 WP, Champion 50 WG, Kocide 2000, Flowbrix…	nejsou ohroženy rezistencí
M 02 Sirnaté fungicidy	síra	Kumulus…., Sulfolac 80 WG, Sulfurus, Thiovit Jet…	nejsou ohroženy rezistencí
M 03 Dithiokarbamáty	mancozeb	Dithane DG Neotec, Manfil 75 WG, Manzate 75 WG, Mastana SC, Novozir MN 80 New, Penncozeb 75 DG	nejsou ohroženy rezistencí
	metiram	Polyram WG
M 04 Ftalimidy	captan	Captan 80 WG, Merpan 80 WG, Scab 480 SC, Flint Plus, Ventur 80 WG	nejsou ohroženy rezistencí
M 09 Chinony	dithianon	Delan Pro, Delan 700 WDG, Faban, Tercel	nejsou ohroženy rezistencí

Použitá literatura je u autora.